作者信息：赵丹1张也2许东升3，4

DOI:10./j.issn.l-l..11.

基金项目：国家自然科学基金面上项目(,)

1医院康复中心,上海市,;2上海交通医院康复医学科;3上海中医药大学附医院康复中心;4通讯作者

第一作者简介:赵丹，女，硕士研究生;收稿日期:-07-26

摘要

目的:观察脊髓损伤后早期应用神经环路磁刺激治疗对星形胶质细胞活化的作用，探讨双靶区神经环路磁刺激促进脊髓损伤康复的作用机制。

方法：将36只成年雄性SD大鼠随机分成3组,Sham+SS组：假手术+假刺激组,SCI+SS组：SCI+假刺激组.SCI+NCMS组:SCI+神经环路磁刺激组，每组12只。建立脊髓损伤大鼠模型，术后第3天SCI+NC-MS组接受真刺激，另外两组接受假刺激.每日1次，每周5次，共3周，分别在术前、术后ldJd.7dJ4d.21d采用BBB评分、斜板试验评价运动功能;治疗结束后处死大鼠并提取损伤区脊髓.HE染色观察各组损伤区脊髓的病理变化;WesternBlot测定各组脊髓中胶质纤维源性酸性蛋白(GFAP)的表达。

结果：①行为学：BBB评分和斜板试验显示SCI+NC-MS组术后7d、14d、21d的运动功能显著优于SCI+SS组(P0.);②HE染色显示，相对于SCI+SS组，SCI+NC-MS组的脊髓结构改善，病变程度相对减轻;③WesternBlot显示，和SCI+SS组相比,SCI+NC-MS组的GFAP蛋白表达量明显降低(P0.05)。

结论：双靶区神经环路磁刺激的早期应用可以抑制星形胶质细胞活化，减少脊髓损伤区胶质瘢痕形成.促进运动功能康复。

关键词：脊髓损伤;神经环路磁刺激;星形胶质细胞;胶质瘢痕

脊髓损伤(spinalcordinjury,SCI)后由于中枢神经系统结构和功能的可塑性变化，导致患者损伤平面以下出现一系列感觉、运动等方面的功能障碍巴目前如何促进患者运动功能康复仍然是一个世界性的康复难题。脊髓损伤涉及复杂的病理生理过程叫脊髓损伤后星形胶质细胞迅速被激活进而转化为反应性星形胶质细胞巴其表现形式主要包括星形胶质细胞肥大、增殖、迁移和结构性蛋白如胶质纤维源性酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein,GFAP)表达增加。早期轻度的反应性星形胶质细胞可以局限炎症因子的扩散，减轻继发性损伤巴但过度增生的反应性星形胶质细胞会形成致密的胶质瘢痕，同时会分泌大量抑制性因子如硫酸软骨素，严重阻碍了神经的修复与再生叫因此，选择星形胶质细胞的干预时间窗非常重要。目前，经颅磁刺激(transcranialmagneticstimulation,TMS)已经成功广泛地应用于多种疾病的治疗如疼痛、抑郁、脑卒中等近年来国内外多项研究也表明经颅磁刺激可以无创地改变中枢神经系统的可塑性，成为一项有效治疗脊髓损伤的神经调控技术叫本课题组在经颅磁刺激的基础上，采用双靶区神经环路磁刺激(neuralcircuitmagneticstimulation,NCMS)方案治疗脊髓损伤，临床上已初见成效问。因此.本实验制备钳夹型T10脊髓损伤大鼠模型，利用NC-MS方案干预治疗,观察其对脊髓损伤后运动功能康复和星形胶质细胞的影响，探讨NC-MS方案促进脊髓损伤康复的作用机制.从而推动该治疗技术在临床康复中进一步应用。

材料与方法

实验器材与试剂①器材:手术器械(深圳瑞沃德公司);动脉瘤夹(美国FST);MagProX重复经颅磁刺激仪(丹麦MagVenture);②试剂：戊巴比妥钠;兔源GAPDH抗体(美国Abeam);兔源GFAP抗体(美国Abeam);山羊抗兔二抗(上海碧云天生物技术有限公司);HRP化学发光试剂盒(美国Millipore);HE染色试剂盒(武汉赛维尔生物科技有限公司)。

实验分组和模型制备36只成年雄性清洁级SD大鼠[上海杰斯捷实验动物有限公司.SCXK(沪)—],体重—g,随机分为3组，分别为Sham+SS组:假手术+假刺激组，SCI+SS组:脊髓损伤+假刺激组，SCI+NC-MS组：脊髓损伤+神经环路磁刺激组，每组12只。本研究方法医院中心实验室实验动物伦理委员会批准，按Rivlin等何的方法制备钳夹型T10脊髓损伤大鼠模型。脊髓损伤：术前禁食禁水至少6h,腹腔注射4ml/kg的1%戊巴比妥钠保证麻醉成功，备皮消毒，以T10棘突为中心纵行切开约3cm的伤口，钝性分离两侧肌肉暴露T9—12棘突，去除T10和T11的棘突和两侧部分椎板(不超过两个棘突),完整清晰地暴露脊髓，持三角针尖端,利用钝端在椎体与脊髓硬脊膜之间形成通道，然后持动脉瘤夹(美国FST,50g)穿过通道，完全垂直跨过T10脊髓，钳夹20s(见图1A),观察到大鼠后肢突然剧烈抽搐和尾巴摆动，提示造模成功。去除动脉瘤夹,钳夹部位的脊髓明显血肿.清理手术视野.逐层缝合，根据出血量腹腔注射生理盐水3—5ml。将其放在加热垫上直至完全苏醒。假手术组：假手术组大鼠仅暴露T10—11脊髓.形成通道，不损伤脊髓，止血消毒后逐层缝合。术后单笼饲养，勤换垫料，给足食物和水;为预防尿路感染和肠梗阻.术后腹腔注射青霉素20万IU/d,—共7天;每日早晚8点各进行一次腹部按摩和膀胱排尿，直到自主排尿功能恢复。

NC-MS方案术后第3天开始给予NC-MS方案干预,仪器为MagProX重复经颅磁刺激仪(丹麦MagVenture)，线圈大小为直径9cm的圆形线圈，将大鼠清醒地固定在自制的大鼠固定器上。NC-MS方案共有两个刺激点(见图1B)S第一个刺激点是大鼠头部左侧Ml区(鼻根至枕骨粗隆连线与两外耳孔连线的交点),刺激强度为80%静息运动阈值(造模前测定静息运动阈值约为最大刺激强度的40%),刺激频率为25Hz.共计个脉冲;第二个刺激点是两侧L5神经根，大鼠脊柱下端的钝形突起是髓关节，其水平连线对应大鼠的L6,向上一节段即为L5。刺激强度为80%静息运动阈值.刺激强度为25Hz,共计个脉冲。治疗时保持周围环境的相对安静.每天1次，每周5次，共3周。假刺激组圆形线圈与刺激点垂直,大鼠仅接受声音刺激。

观测指标：运动功能评价:分别在术前、术后ld、3d、7d、14d、21d采用Basso-Beattie-Bresnahan(BBB)评分、斜板试验进行运动功能评价每次行为学评价时间均为早上8：00—10：00,大鼠在半径为lm的开口无障碍平台上自由活动5min,按BBB量表观察评分,取平均值;大鼠平放在可自由调节角度的木板上，逐渐增加木板倾斜角度，直到调节到大鼠在斜板上刚好可以稳定5秒的最大角度，测量3次取平均值。运动功能评价均双人双盲。

HE染色观察损伤区脊髓的病理变化:腹腔注射4ml/kg的1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，先后经0.9%生理盐水和4%多聚甲醛灌注，取损伤节段及上下共lcm的脊髓.浸泡在多聚甲醛中过夜，石蜡包埋切片，切片厚度5pm。按试剂盒进行HE染色,显微镜下观察病理学变化。

WesternBlot检测GFAP的表达水平：腹腔注射4ml/kg的2%戊巴比妥钠深度麻醉大鼠，冰上迅速取损伤节段及上下共lcm的脊髓，移入干净EP管。按实验步骤进行WesternBlot.以GAPDH为内参对照，AlphaView软件测量光密度值，利用目的蛋白与内参的比值进行半定量分析。

统计学分析：实验数据采用SPSS20.0进行分析。计量资料用均数士标准差表示。运动功能的行为学结果选用双因素方差分析，其余结果的组间比较选用单因素方差分析。P0.05认为差异有显著性意义。

结果

NC-MS方案可以促进脊髓损伤后运动功能康复

分别在术前Id、术后ld、3d、7d、14d、21d采用BBB评分、斜板试验进行运动功能的评价，见图2A。BBB评分显示SCI+SS组和SCI+NC-MS组随着恢复时间，其得分逐渐增高.SCI+SS组和SCI+NC-MS组的BBB评分均低于Sham+SS组(P0.),SCI+NC-MS组从第7天起BBB评分明显高于SCI+SS组(P0.).见图2B?斜板试验显示Sham+SS组斜板试验的角度都高于SCI+SS组和SCI+NC-MS组(P0.),SCI+NC-MS组从第7天起斜板试验角度显著高于SCI+SS组(P0.),见图2CBBB评分和斜板试验的结果提示脊髓损伤后神经环路磁刺激早期干预可以促进SCI大鼠肢体的运动功能恢复。

NC-MS方案可以减轻脊髓损伤后病理程度

Sham+SS组脊髓结构正常完整，灰质白质界线清晰;SCI+SS组脊髓结构明显破坏，白质中岀现空泡样结构,神经元坏死并数量减少,大量炎性细胞浸润占SCI+SS组比较，SCI+NC-MS组的脊髓结构损伤程度减轻,脊髓结构趋于正常，神经元数量变多,炎性细胞浸润减少，见图3。这说明脊髓损伤后神经环路磁刺激早期干预可以减轻损伤区的病理变化，保护脊髓结构。

NC-MS方案可以下调损伤节段GFAP的表达

WesternBlot显示(如图4A),脊髓损伤21d后,GFAP蛋白的相对表达量显著升高(P0.01);NCMS方案干预可以明显下调GFAP蛋白的表达(P0.05),见图4B。这表明脊髓损伤后神经环路磁刺激早期干预可以下调GFAP表达，降低星形胶质细胞的活化,从而减少胶质瘢痕的形成。

讨论

脊髓损伤后星形胶质细胞被激活，发生结构和功能性改变，结构蛋白GFAP的表达量显著上升问,脊髓损伤后约14天，反应性星形胶质细胞在损伤区域形成致密性胶质瘢痕。胶质瘢痕在炎症反应、轴突再生中的作用一直被认为是一把双刃剑巴早期胶质瘢痕可以保护损伤区域.改善微环境，但在后期胶质瘢痕是抑制神经再生与修复的物理与化学双重屏障，因此针对早期星形胶质细胞活化的研究是减轻脊髓损伤程度的一个关键性治疗靶点。研究也表明在脊髓损伤早期应用药物治疗可以抑制星形胶质细胞的活化，从而有效减少胶质瘢痕的形成何，而物理因子治疗如电刺激冋、激光W同样可以通过抑制星形胶质细胞的活化减少胶质瘢痕形成,促进脊髓损伤运动功能恢复。因此探索新的抑制胶质瘢痕形成的神经调控技术来促进神经环路的重建，是脊髓损伤后康复的新靶点。

近年来磁刺激技术在脊髓损伤的评估和治疗中的作用得到越来越多的